ARTIGO

Influência da Spirulina LEB-18 em tamanho nanométrico no metabolismo de ratos fêmeas Wistar

Influence of the cyanobacteria Spirulina LEB 18 in metabolism of female Wistar rats

Adriana R. Machado¹, Rosane S. Rodrigues², Mirian R. G. Machado² e Leonor A. Souza–Soares¹

 

¹ Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande – FURG. Avenida Itália KM.8 - Cep: 96203-900 – Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil. E-mails: adriana.rodriguesmachado@yahoo.com.br, author for correspondence; leonor.souzasoares@gmail.com

² Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Química de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas. CEP 96010-900, Campus Capão do Leão s/n, prédio 4, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. E-mails:rosane.rodrigues@ufpel.tche.br; miriangalvao@gmail.com

 

RESUMO

Objetivo do estudo consistiu em avaliar a influência de dietas contendo Spirulina LEB-18 em tamanhos micrométrico e nanométrico no metabolismo de ratas Wistar/UFPel. As ratas foram divididas em quatro grupos (n=6) e alimentadas por 15 dias com as dietas (20g/dia): Controle à base de caseína (C), Spirulina à base de Spirulina micrométrica (Sma), Spirulina nanométrica (Sna) e aproteica (Aa). Para determinação dos indicadores biológicos da proteína utilizaram-se a Retenção Protéica Líquida (RPL) e o Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA). Ao final do ensaio os animais foram eutanasiados por decapitação e o sangue coletado para análises de hemograma e obtenção do soro (determinação de colesterol total e triacilgliceróis). As dietas contendo Spirulina cepa LEB-18 nos tamanhos micrométrico e nanométrico foram eficientes no crescimento, não interferindo no metabolismo e apresentando respostas semelhantes à dieta controle contendo caseína (C).

Palavras-chave: Nanopartícula, Rattus norvegicus, Spirulina

 

ABSTRACT

Aim of the study was to investigate the influence of diets containing Spirulina LEB-18 micrometer and nanometer size in the metabolism of Wistar/UFPel. The rats were divided into four groups (n = 6) and fed for 15 days with diets (20g/ day): Control based on casein (C), Spirulina based Spirulina-micrometer (Sma), Spirulina nanometer (Sna) and aproteic (Aa). To determine the biological indicators of protein used to Net Protein Retention (NPR or RPL) and Food Efficiency Coefficient (CEA). At the end of the experiment the animals were euthanized by decapitation and blood was collected for analysis of blood test and obtained serum (determination of total cholesterol and triglycerides). Therefore diets containing Spirulina strain LEB-18 in micrometer and nanometer sizes were efficient growth, not interfering with the metabolism and presenting answers similar to the control diet containing casein (C).

Keywords: Nanoparticle, Rattus norvegicus, Spirulina

 

Introdução

As microalgas são microrganismos heterogeneos, usualmente microscópicos, unicelulares, coloniais ou filamentosos, coloridos e fotoautotróficos. Filogeneticamente podem ser procarióticos ou eucarióticos (Olaizola, 2003). O cultivo de microalgas está crescendo gradativamente e a biomassa produzida destina-se às mais diversas aplicações como produção de proteína unicelular, lipídios, carotenóides, clorofila, enzimas, ésteres, antibióticos, hidrocarbonetos e vitaminas (Durand-Chastel et al., 1980; Becker, 1994; Pulz e Gross, 2004; Richmond, 2004).

A Spirulina é uma microalga que se destaca por sua composição química, com alta qualidade e quantidade de proteínas, aminoácidos essenciais, minerais, ácidos gordos poliinsaturados e vitaminas. Além disso, apresenta compostos fenólicos (ácidos cafeico, clorogênico, salicílico, trans-cinâmico), tocoferol e pigmentos (carotenóides, ficocianina e clorofila), aos quais são atribuídas suas propriedades potencialmente funcionais (Parisi et al., 2009), mais especificamente a redução do risco da ocorrência de distúrbios fisiológicos como diabetes, artrite, anemia, desnutrição, obesidade, tensão pré-menstrual, doenças cardiovasculares (Ambrosi et al., 2008) e alguns tipos de câncer. Neste último a açãoda microalga parece estar associada à presença de β-caroteno, precursor da vitamina A, o qual apresenta capacidade de controlar a diferenciação e proliferação celulares nos epitélios (Colla et al., 2008), ocorrência usual em cânceres. Nas condições usuais nas quais a microalga é aplicada aos alimentos não apresenta toxicidade para seres humanos e nem prejuízos para o desenvolvimento de órgãos e tecidos, quando utilizada nos limites estipulados pela legislação.

A indicação da segurança de uso, associado às evidências de ação fisiológica e a composição química têm estimulado diversas outras pesquisas para a avaliação nutricional e funcional da Spirulina (Ambrosi et al., 2008; Colla et al., 2008; Moreira et al., 2011). Sua aplicação em alimentos é basicamente naforma de biomassa seca sendo recebida em pellets etriturada em moinho de bolas, peneirada em agitadorde peneiras, alcançando uma granulometria deaproximadamente 30 a 40 mesh, respectivamente (0,600 e 0,400 mm).

Considerando o alto valor nutricional e funcional da Spirulina, a redução de seu tamanho pode melhorar a absorção destes componentes no organismo, modificando-os. A nanotecnologia tem sido um auxílio potencial aos avanços na produção de alimentos de qualidade melhorada com propriedades funcionais (Cushen et al., 2012). A nanotecnologia é focada em caracterização, fabricação, manipulação e aplicação de estruturas biológicas e não biológicas (Sahoo et al., 2007) na escala nanométrica. Estruturas nessa escala apresentam propriedades funcionais únicas não encontradas na escala macro (Chau et al., 2007). Uma das possíveis vantagens da utilização dessas nanopartículas em alimentos está relacionada com a facilidade de atingir órgãos, auxiliando os efeitos nutricionais e funcionais quando comparado com o material em tamanho macrométrico.

O objetivo do estudo foi verificar o efeito de dietas contendo Spirulina nos tamanhos micrométrico e nanométrico no metabolismo de ratas cepa Wistar/ UFPel.

 

Material e métodos

Obtenção da matéria–prima

A biomassa da microalga Spirulina (LEB cepa-18) foi fornecida pelo Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande, isolada da lagoa Mangueira (33° 302 133 S, 53° 082 593 O), localizada em Santa Vitória do Palmar, RS, Brasil (Morais e Costa 2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (Costa et al., 2004). A biomassa foi fornecida seca em forma de pellets, sendo posteriormente triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2) e peneirada em agitador de peneiras, 200 mesh, para homogeneização do tamanho das partículas, alcançando uma granulometria de 88 µm. A biomassa em forma de pó foi acondicionada à vácuo em embalagens de polietileno de alta densidade (PEAD), com capacidade para 500 g, e armazenada sob refrigeração à temperatura de ±7^oC até o momento da realização das análises.

Animais

Foram utilizados 24 ratos fêmeas da espécie Rattus norvergicus, cepa Wistar/UFPel, desmamados aos 21 dias de vida e com peso médio em torno de 57,97 g. Os animais foram divididos em quatro grupos (n=6): Controle com dieta à base de caseína (C); aproteico (Aa); Spirulina micrométrica (Sma) com dieta à base de Spirulina em tamanho micrométrico (1x10^-6 µm); e Spirulina nanométrica (Sna) com dieta à base de Spirulina em tamanho nanométrico (1x10^-9 nm). As dietas isocalóricas foram fornecidas em 20g/dia e água ad libitum, durante 15 dias. Os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas individuais, em ambiente com temperatura constante (24^oC ± 2^oC), troca de ar por exaustão a cada 12h e iluminação adequada (ciclo claro e escuro de 12 horas).

Todos os procedimentos experimentais obedeceram às normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal –COBEA (1991) e da Comissão de Ética e Experimentação Animal - CEEA da Universidade Federal de Pelotas (Registro do protocolo nº23110.000978/2010-91).

Preparo das dietas

As dietas foram balanceadas segundo as recomendações de Reeves et al. (1993) e preparadas para apresentarem teores em torno de 12% de proteína para se adequarem à metodologia utilizada (Quadro 1).

 

 

Transformação da Spirulina LEB-18 em Spirulina nanométrica

A Spirulina foi reduzida ao tamanho nanométrico segundo metodologia proposta por Malheiros et al. (2010), com modificações, na qual foram tomados 4g de Spirulina (LEB-18), em tamanho micrométrico dissolvidos em 100 mL de solução tampão fosfato na concentração 0,2 M, pH 7,0, procedendo-se o aquecimento do balão a 60^oC em banho-maria, e agitação em vórtex. Em seguida a mistura foi conduzida ao ultra turrax para homogeneização das partículas, a 10000 rpm, por 20 minutos.

Avaliações biológicas, nutricionais e bioquímicas

Para determinação dos indicadores biológicos e nutricionais da proteína utilizaram-se os testes de Retenção Protéica Líquida (RPL) e o Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA), após 15 dias (Sgarbieri, 1996).

Retenção Proteica Líquida (RPL) ou Quociente de Eficiência Líquida (NPR)

A Retenção Protéica Líquida (RPL) é uma modificação do PER (Quociente de Eficiência Protéica). Tem a duração de 15 dias e utiliza, além das dietas a se-rem testadas, um controle negativo (dieta aproteica) e um positivo (dieta à base de caseína ou padrão). O RPL foi calculado de acordo com Bender e Doell (1957a;b):

 

 

Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA): O ganho de peso e a ingestão de dieta por animal foram utilizados para determinar o coeficiente de eficiência alimentar (CEA).

No final do ensaio, os animais foram eutanasiados por decapitação e a coleta sanguínea realizada de duas formas: a) 1 mL do sangue foi disposto em eppendorf com anticoagulante EDTA e destinado para análise de hemograma em contador hematológico automático (POCH-100IVDIFF, SYSMEX); e b) o restante centrifugado a 1000 g por 15 minutos a 4 ^oC em tubos de ensaio para obtenção do soro, o qual foi armazenado a -18 ^oC para posterior análise de colesterol total e triacilgliceróis em equipamento automatizado LabMax 240 (LABTEST DIAGNÓSTICA S.A.).

Análise estatística

Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, versão 7.0 (Statistica, 2004), sendo realizada a análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey (p=0,05) para a comparação das médias.

 

Resultados e discussão

O Quadro 2 apresenta as respostas nutricionais dos ratos fêmeas cepa Wistar/UFPEL submetidos às diferentes dietas experimentais, durante 15 dias.

 

 

Verificou-se que não ocorreram alterações no peso corporal dos animais alimentados com dietas à base de Spirulina (Sma e Sna) quando comparados com o grupo controle. Os valores de ingestão protéica foram também semelhantes entre as duas condições nutricionais (controle e Sma), no qual ambas diferiram (p=0,05) da Spirulina nanométrica, porém indicando que esta fonte alternativa de proteína proveniente de biomassa não comprometeu o crescimento de animais. Estes resultados corroboram o estudo de Tranquille et al. (1994) que compararam dietas à base de Spirulina e caseína e Spirulina em pellet e de Rogatto et al. (2004) com uma dieta com 17% de Spirulina em substituição total à proteína da dieta controle (caseína) em ratos machos jovens Wistar, nos quais ambos verificaram que a Spirulina não causou prejuízo no crescimento dos roedores.

Os animais alimentados com as dietas estudadas não diferiram estatisticamente em relação ao coeficiente de eficiência alimentar (CEA), estando o valor próximo ao obtido por Chaud et al. (2008) que foi de 0,30. Conforme estes autores, a redução da eficiência alimentar ocorre devido à diminuição metabólica do organismo frente à determinada dieta, causando estagnação ou redução do peso corporal. O RPL é a técnica utilizada para avaliar a qualidade da proteína de um alimento em relação ao padrão de caseína. O grupo que recebeu a Spirulina nanométrica diferiu (p=0,05) dos demais em relação a este parâmetro. Gomes et al. (2000), em trabalho com ratos, encontraram valores de RPL de 4,70 para caseína, 2,70 para farelo de soja não tratado com bipiridilios, 2,60 para o tratado e 3,70 para o mesmo produto peletizado e tratado. Já Souza et al. (2000), em estudo sobre síntese e caracterização nutricional de plasteína obtida da proteína da folha de mandioca, da soja, e do soro de queijo, obtiveram para caseína 4,03 e sobrenadante plasteína 3,80 e plasteína precipitada 3,75, valores abaixo do encontrado neste estudo com Spirulina.

Nos Quadros 3 e 4, respectivamente, estão os dados das avaliações hematológicas e de colesterol total e triacilgliceróis de ratas wistar submetidas às diferentes dietas.

 

 

 

 

Ao relacionarem-se as quantidades médias de proteínas consumidas pelos ratos durantes 15 dias, vê-se que, apesar das quantidades diferirem estatisticamente entre os grupos, o mesmo não ocorreu nas repostas dos parâmetros hematológicos dos ratos. Pode-se interpretar que embora haja diferença em alguns parâmetros nutricionais onde são computados, consumo, ganhos de peso e perdas de peso (Quadro 2) as respostas dos parâmetros hematológicos indicam que o metabolismo protéico permaneceu inalterado neste período de 15 dias.

Os grupos que consumiram as diferentes dietas não diferiram (p>0,05) em relação ao hematócrito (Ht) que resulta da proporção entre o volume dos eritrócitos e do sangue total, sendo expresso como uma porcentagem (%) do sangue total. De acordo com Miller (1993) o valor de hematócrito é fundamental no estudo de todos os tipos de anemia, além disso, seus resultados estão menos sujeitos a erros do que a contagem de hemácias. Os níveis de hematócrito em todos os grupos estão de acordo com outros estudos cujos valores variam entre 36 e 48% (Harkness e Wagner, 1993; Boaventura et al., 2003; Duarte et al., 2009; Moreira et al., 2011).

Os valores de hemoglobina para roedores oscilam de 11 a 18% (Harkness e Wagner, 1993), também neste estudo onde os grupos não diferiram entre si, e cujos valores aproximam-se dos encontrados por Verruma-Bernardi et al. (2009). A albumina plasmática é boa indicadora do estado nutricional e, neste caso, os valores obtidos nesta pesquisa apresentam-se dentro dos padrões de normalidade para a espécie em estudo (Souza-Soares et al., 2009). Santos et al. (2004) encontraram 3,01 g dL^-1 de albumina para a dieta caseína e 2,68 g dL^-1 para dieta suplementada com multimistura, estando este valor próximo aos deste estudo. Conforme a literatura, ratos sadios possuem teor de albumina na faixa de 3,4 a 4,3 g dL^-1 (Souza-Soares et al., 2009). Com relação às proteínas totais (5,72-6,12 g dL^-1), não houve diferença significativa entre os grupos. Uma dieta creche suplementada com multimistura apresentou proteínas totais inferiores a este estudo, no qual encontraram valores de 4, 48 g dL^-1 e para dieta caseína 5,53 g dL^-1 (Santos et al., 2004).

Os eritrócitos apresentaram valores de acordo com Souza-Soares et al. (2009), de 7 a 10 milhões/mm³ de eritrócitos. Os eritrócitos ou hemácias são os elementos figurados presentes em maiores quantidades no sangue e sua baixa contagem indica deficiência em ferro e estado anêmico.

Os basófilos desempenham papel importante nas respostas imunitárias corporais, pois ao menor contato com uma substância alergênica liberam mediadores químicos, como a histamina, a qual atrai as demais células de defesa (Miller, 1993). Em ratos são raros ou poucos; sendo esta escassez circulante uma característica para a classe dos mamíferos, de uma forma geral (Messias, 2009). Souza-Soares et al. (2009) e Anthony et al. (2006) preconizam como valores normais a faixa entre 0 e 1% de basófilos, os quais não foram detectados nos animais em estudo demonstrando que, nas doses utilizadas (4 g de spirulina micrométrica e 1,6 g de spirulina nanométrica correspondendo a 20 g de dieta por/dia), a Spirulina tanto no tamanho micrométrico como nanométrico não induz a uma imuno-resposta.

Os grupos em estudo não diferiram significativamente para colesterol total e para triacilgliceróis indicando que a Spirulina LEB-18, em diferentes tamanhos, não interferiu nos parâmetros avaliados. Melo et al. (2008), em suas dietas experimentais com farinha de folhas de mandioca obtiveram valores próximos aos deste estudo para colesterol total e triacilgliceróis, também utilizando ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar.

Marco (2008) no estudo com animais que consumiram uma multimistura com adição de farelo de arroz e Spirulina encontrou 64,5 mg dL^-1 de colesterol, valor abaixo deste estudo. A faixa considerada normal para a espécie, contudo, é variável na literatura, onde são relatados valores entre 20 e 120 mg dL^-1 (Canadian Council on Animal Care, 1993; Harkness e Wagner, 1993; Dantas et al., 2006; Centro de Bioterismo da FMUSP, 2008; Souza-Soares et al., 2009). Apesar dos resultados citados, ratos são bastante resistentes em desenvolver hipercolesterolemia e aterosclerose, possivelmente em razão do aumento na conversão de colesterol em ácidos biliares no fígado (Machado et al., 2003).

Alguns estudos abordam a redução da hipercolesterolemia pelo consumo de Spirulina. O primeiro relato de redução de colesterol sérico pela ingestão de S. platensis foi feito em ratos por Devi e Venkataraman (1983). Desde então, diversos pesquisadores confirmaram esta descoberta em experimentos com animais e seres humanos. Em estudo feito por Kato et al. (1984) em ratos, os níveis de colesterol total e fosfolipídios séricos foram aumentados através de uma dieta contendo 1% de colesterol. Estes níveis elevados foram claramente reduzidos com a introdução de 16% de S. platensis à dieta anterior (Kato et al., 1984; Belay et al., 1993, Ambrosi et al., 2008).

Os grupos não diferiram (p>0,5) em relação aos triacilgliceróis e os valores resultantes das dietas Sma e Sna foram próximos aos encontrados por Moreira (2010), de 66 a 78 mg dL^-1, em sua pesquisa sobre efeito de diferentes concentrações de Spirulina LEB 18 nos perfis bioquímico, hematológico e nutricional de ratos Wistar nutridos e desnutridos Na literatura são citados valores entre 26 e 110 mg dL^-1 para este parâmetro (Harkness. e Wagner, 1993; Dantas et al., 2006; Centro de Bioterismo da FMUSP, 2008; Souza-Soares et al., 2009). Tal variação está relacionada ao fato de que os triacilgliceróis constituem a reserva energética dos animais e sua concentração varia em função do consumo e armazenamento de todo o excesso de nutrientes, seja carboidrato, proteína ou o próprio lipídio (Vaz et al., 2006).

 

Conclusões

A Spirulina nos tamanhos micrométrico e nanométrico foi capaz de promover o crescimento das ratas, sem interferência no metabolismo das mesmas, alcançando resultados comparáveis à caseína.

 

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Recebido/Received: 2013.09.16

Aceitação/Accepted: 2013.12.15