SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.33 número1Variabilidad espacial de los atributos físico-hídricos del suelo y de la productividad del cultivo de fréjol (Phaseolus vulgaris L) irrigado bajo un sistema de siembra directaInfluência do comprimento do sulco sobre a equação de infil­tração obtida pelo método dos dois pontos de Elliot & Walker índice de autoresíndice de assuntospesquisa de artigos
Home Pagelista alfabética de periódicos  

Serviços Personalizados

Journal

Artigo

Indicadores

Links relacionados

  • Não possue artigos similaresSimilares em SciELO

Compartilhar


Revista de Ciências Agrárias

versão impressa ISSN 0871-018X

Rev. de Ciências Agrárias v.33 n.1 Lisboa jan. 2010

 

Efeito da temperatura, pH e vestígios de Hg2+ e Pb2+ na acti­vidade de desidrogenases e urease num solo da região deÉvora

 

M. R. Martins1,2, F. Santos1, P. Candeias1 & J. Cruz-Morais1,2

1 Departamento de Química, Universidade de Évora, Rua Romão Ramalho, 7000-671 Évora, e-mail: cmorais@uevora.pt;

2ICAM, Universidade de Évora, Apartado 94, 7002-554 Évora

 

RESUMO

As actividades das enzimas no solo são um importante indicador da sua qualida­de. Neste estudo procedeu-se à caracteri­zação da actividade enzimática de desi­drogenases (EC 1.1.1) e da urease (EC 3.5.1.5) de um solo sob Olea europeae L. da região de Évora. As constantes cinéti­cas Km e Vmáx, foram determinadas usando como substratos o cloreto de p­-iodonitrotetrazolio (INT) e a ureia, res­pectivamente. Foi avaliado o efeito nas referidas actividades provocado pelo pH, temperatura e vestígios de Hg2+ e de Pb2+.

As actividades máximas obtiveram-se a pH = 8,5 e 40 ºC, com Km= 0,5 mM e Vmáx = 5,4 µmol min-1 g-1, para a activida­de de desidrogenases e a pH = 10 e 37 ºC, com Km = 25,7 mM e Vmáx = 2,0x10-2 µmol min-1 g-1, para a urease. Estas acti­vidades foram inibidas por diferentes concentrações de Hg2+, mas apenas a acti­vidade da urease foi inibida pelo Pb2+. Estes resultados são comparáveis com os referidos na literatura para estes enzimas.

Palavras-chave: Desidrogenases, Enzi­mas do solo, Qualidade do solo, Urease.

 

Effect of temperature, pH and Hg2+ and Pb2+ traces in dehydrogenaseand urease activities of a soil from Évora region

ABSTRACT

Enzyme activities are often used as in­dicator of soil quality. This study reports on dehydrogenase (EC 1.1.1) and urease (EC 3.5.1.5) activities of a soil under Olea europaea L. from Évora region. Kinetic constants Km and Vmax were determined using p-iodonitrotetrazolium chloride (INT) and urea, respectively. Effects of pH, temperature and Hg2+ and Pb2+ traces on both activities were determined.

Maximal activity was obtained at pH = 8.5 and 40ºC, Km = 0.5 mM and Vmax=5,4µmol min-1 g-1 , for dehydro­genase and at pH = 10 and 37 ºC, Km = 25.7 mM and Vmax = 2.0x10-2 µmol min-1 g-1, for urease. These activities were in­hibited by different concentrations of Hg2+, but only the urease activity was in­hibited by Pb2+. Results of this study are comparable to those reported in the litera­ture for these enzymes.

Key-words: Dehydrogenases, Soil enzyme, Soil quality, Urease.

 

INTRODUÇÃO

A qualidade do solo depende de proprie­dades físico-químicas e biológicas relacio­nadas com a sua textura, composição, humidade, pH, microrganismos e enzimas activos nele presentes, os quais podem ser influenciados pelo tipo de culturas, mobili­zação do solo e aplicação de xenobióticos, como produtos fitofarmacêuticos, poluentes de origem industrial, municipal ou outros. Os enzimas do solo têm um papel relevante na libertação dos nutrientes necessários ao crescimento microbiano e das plantas e na biotransformação de xenobióticos (Dick, 1998). As actividades enzimáticas do solo podem resultar de células activas (animais, plantas e microrganismos), células inteiras já mortas, detritos celulares ou, ainda, de complexos enzima-argila ou colóides húmi­cos (Taylor et al., 2002).

As actividades enzimáticas de desidroge­nases (E.C. 1.1.1), fosfatases (EC 3.1.3.), arilsulfatase (EC. 3.1.6.1.), celulase (E.C. 3.2.1.4), β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21) e urease (E.C. 3.5.1.5) têm sido utilizadas, nalguns estudos, como indicadores da qua­lidade do solo. Desidrogenases, por exem­plo, são enzimas endocelulares, presentes apenas nas células viáveis e a sua actividade no solo está descrita como reflexo da activi­dade de microrganismos, incluindo bactérias e fungos, pelo que é frequentemente utiliza­da como indicador do metabolismo oxidati­vo microbiano em função do tipo, profundi­dade, conteúdo de matéria orgânica e poluentes do solo (Camiña et al. 1998; Tra­sar-Cepeda et al., 2000; Monkiedje et al., 2002; Taylor et al., 2002; Sukul, 2006).

A urease é um enzima extracelular, tam­bém presente no interior das células, res­ponsável pela hidrólise da ureia no solo, com formação de ião amónio e carbonato. A sua actividade está correlacionada com o processo de mineralização do N no solo e a sua presença aqui é originada principalmen­te a partir de plantas e microrganismos (Marzadori et al., 1998; Sinsabaugh et al., 2000).

A acumulação de metais pesados no solo em quantidades elevadas é um dos factores de maior impacte nos seus processos bio­químicos. Alguns estudos mostram que a presença de metais pesados inibe a activida­de de diversos enzimas do solo (Mora et al., 2005; Chaperon et al., 2007, 2008). O grau de inibição das actividades enzimáticas do solo pelos metais pesados está estreitamente correlacionado com o tipo de solo (Brady & Ray, 1999). Mora et al. (2005) refere que solos contaminados com os metais As, Cd, Cu, Mn, Pb e Zn apresentaram actividades enzimáticas de desidrogenases, arilsulfatase e β-glucosidase muito baixas, as quais aumentaram após remediação “ in situ” (Sevilha, Espanha). Segundo Chaperon et al. (2007, 2008), a presença de Ag, Cu, Pb, Zn e Hg influenciou as actividades de desi­drogenases e da urease em solos de floresta (Canadá), dependendo da concentração, da presença simultânea de alguns destes metais e do tipo de solo.

Estudos de caracterização de actividades de desidrogenases e urease nos solos de Por­tugal são muito escassos, pelo que foi objec­tivo do presente estudo caracterizar a activi­dade enzimática de desidrogenases e da urease num solo da região de Évora (Alente­jo) e avaliar o efeito de Hg2+ e Pb2+, nessas actividades. A actividade de desidrogenases foi determinada pelo método de von Mersi & Schinner (1991) modificado (Camiña et al., 1998) e a da urease pelo método de Kandeler & Gerber (1988) modificado. As constantes cinéticas, Km e Vmáx foram deter­minadas utilizando como substratos o p-iodonitrotetrazolio (INT) e a ureia, para desidrogenases e urease, respectivamente. Foi ainda avaliado o efeito da temperatura, pH e de vestígios de Hg2+ e Pb2+ nas referi­das actividades.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Estudou-se um solo do sudoeste de Portu­gal situado em Évora, Alentejo (38º36’N, 1º16’W) com cultura de olival (Olea euro­peae L.) em pousio, sem quaisquer trata­mentos com pesticidas, adubos ou fertilizan­tes, durante os últimos 10 anos. De acordo com a carta de solos 36 C dos Solos de Por­tugal, trata-se de um solo litólico, não húmi­co de rochas eruptivas (Pmg) (Cardoso, 1974). As amostras foram recolhidas entre os 5 – 15 cm de profundidade, secas ao ar, crivadas por tamiz de malha < 2 mm e guardadas a 4ºC, para análise.

As principais características físico­químicas do solo foram determinadas de acordo com os métodos de referência para análises do solo (Carter, 1993; Rowell, 1994). Os dados da textura foram obtidos por sedimentometria com raios X (Sedi­graph, 5100), corrigidos para o método da análise mecânica, sem destruição de carbo­natos. O azoto total foi determinado pelo método de Kjeldahl, o azoto nítrico por potenciometria, utilizando um eléctrodo selectivo de iões, e o fósforo pelo método espectrométrico de Egner-Riehm (Green­berg et al., 1992). A capacidade de troca foi determinada pelo método do acetato de amónio a pH = 7 (Rowell, 1994). O Ca2+ foi quantificado por espectrometria de absorção atómica em câmara de grafite e o Na+ e K+ por fotometria de emissão de chama (Rowell, 1994).

A actividade de desidrogenases foi deter­minada em 1 g de solo (p.s.) pelo método de von Mersi & Schinner (1991) modificado por Camiña et al. (1998), utilizando como substrato o cloreto de 2-p-iodofenil-3-p­nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT), que é con­vertido por desidrogenases em iodonitrote­trazólio-formazão (INTF). Este foi extraído com uma mistura de dimetilformamida e etanol, de modo a minimizar a adsorção do INTF aos minerais do solo (Camiña et al., 1998) e quantificado a 490 nm (Taylor et al., 2002). Foi efectuado um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adi­cionado o substrato só após a adição da solução extractante.

A actividade da urease foi quantificada pelo método de Kandeler & Gerber (1988) modificado, sendo o amónio libertado determinado pela reacção de Berthelot, na qual o salicilato de sódio reage com o ácido dicloroisocianúrico, na presença de nitro­prussiato de sódio, formando um complexo esverdeado em meio alcalino (Kandeler & Gerber, 1988; Taylor et al., 2002). Neste ensaio, adicionou-se 1 g de solo (p.s.) a 0,5 mL de solução de ureia 720 mM e 4 mL de solução tampão borato 75 mM, pH 10 e incubação a 37 ºC (b.a.) durante 2 horas, sob agitação. A reacção foi terminada com a adição de 6mL de KCl/HCl pH ~ 2 e, após 30 minutos, procedeu-se à leitura da absor­vência a 690nm. Foi efectuado um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adicionado o substrato só após a adição da solução de KCl/HCl. Em todas as determi­nações enzimáticas, foram efectuados 4 replicados.

O efeito da temperatura nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease foi avaliado fazendo variar a temperatura de incubação do solo entre 20 -50 ºC e o pH entre 6,5 e 12, respectivamente, com base em estudos prévios e nos valores indicados na literatura para estes enzimas (Trevors, 1984; Kandeler & Gerber, 1988; Subhani et al., 2001; Taylor et al., 2002).

As constantes cinéticas Km e Vmáx foram determinadas recorrendo à linearização de Lineweaver-Burk, usando INT (0,25 -1,25 mM) ou ureia (80 – 2560 mM) como subs­trato, para as actividades de desidrogenases e urease, respectivamente.

Os efeitos do Hg2+ e Pb2+ nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease do solo foram determinados adicionando à solução do solo, soluções de HgCl2 (0,23­10,91 mM) e soluções de PbCl2 (0,14 ­10,91 mM). Nos ensaios em que se obser­vou um efeito inibitório, procedeu-se à determinação dos valores de IC50 (concen­tração que levou a uma diminuição de 50% na actividade enzimática, como resposta dos microrganismos sensíveis ao respectivo metal).

Para avaliação do efeito do Hg2+ e Pb2+ nas actividades enzimáticas de desidrogena­ses e urease, procedeu-se à análise de variância (ANOVA -One way) para um intervalo de confiança de 95 % (P < 0,05), usando o programa SPSS® 16.0 para Win­dows.

O efeito inibitório sobre as actividades de desidrogenases e urease provocado por cada um dos metais em estudo foi determinado usando a correlação dose-resposta para cada um dos metais adicionado ao solo. A Equação 1 foi utilizada para cálculo da resposta da actividade enzimática (Greco et al., 1995)

em que A2 e A1 são, respectivamente, as respostas máxima e mínima dos enzimas do solo obtidas com uma amostra controlo, p é o parâmetro de declive da curva dose­-resposta, X é a dose aplicada e log X0 é a concentração que corresponde a 50 % da actividade enzimática. Este modelo não linear foi ajustado utilizando o Origin 7.1 (OriginLab® Corporation, 2003).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O Quadro 1, mostra que o solo apresentou uma textura franco-argilosa, com pH 6,0, baixos valores de condutividade eléctrica e de matéria orgânica, valores estes que se encontram dentro dos limites referidos para um solo do tipo litólico, não húmico de rochas eruptivas (Pmg), como foi o caso do solo em estudo (Cardoso, 1974).

 

Quadro 1-Principais características do solo em estudo

 

Neste estudo, as actividades de desidro­genases e urease do solo, foram determina­das a diferentes valores de temperatura, uti­lizando um valor de pH de ensaio de 8,5 para desidrogenases e de 10,0 para a urease, valores estes seleccionados tendo em conta estudos prévios e também o que se encontra referido na literatura sobre o efeito do pH na actividade destes enzimas (Trevors, 1984; Kandeler & Gerber, 1988).

Na Figura 1, estão representados os valo­res médio ± desvio-padrão da variação das actividades de desidrogenases e urease no solo em função da temperatura (Figura 1-A) e do pH (Figura 1-B).

 

Figura 1 -Representação gráfica do efeito da temperatura (A) e do pH (B) nas actividades de desi­drogenases e urease no solo em estudo.

 

Os valores de temperatura para os quais se obteve a maior actividade de desidro­genases e urease foram, respectivamente, de 40ºC e de 37ºC (Figura 1-A). Estes valores estão muito próximos, no entanto, como se observa na referida figura, o efeito da tem­peratura foi muito mais acentuado para a actividade da urease do que para a activida­de de desidrogenases, o que poderá signifi­car que, sendo a urease um enzima predo­minantemente extracelular, estará menos protegido do que as desidrogenases face a alterações da temperatura ambiental (Dick, 1998; Nannipieri et al., 2003).

Uma vez determinadas as temperaturas para as quais as actividades de desidrogena­ses e urease foram máximas, procedeu-se a um estudo do efeito da variação do pH sobre as actividades destes enzimas a essas tempe­raturas (40 ºC e 37 ºC, respectivamente).

Os resultados deste estudo estão apresen­tados na Figura 1-B, mostrando que estes enzimas apresentaram um perfil semelhante de variação da actividade em função do pH do meio, o que poderá ser devido ao facto de, tanto nos microrganismos (desidrogena­ses), como no solo (urease), existirem sis­temas tampão que moderam o impacte da variação do pH do meio na actividade destes enzimas (Taylor et al., 2002).

Para a actividade de desidrogenases, o valor máximo foi obtido a pH 8,5, enquanto que para a urease a actividade máxima foi obtida a pH 10,0, mostrando que, no solo em estudo, a actividade destes enzimas face ao pH seguiu um padrão de comportamento dentro do que está referido para estes enzi­mas (Dick, 1998; Taylor et al., 2002).

Os parâmetros cinéticos das actividades de desidrogenases e urease foram determi­nados a 40ºC, pH = 8,5 e 37 ºC, pH = 10, respectivamente. Para este estudo foram usadas diferentes concentrações dos substra­tos ([S]) característicos destes enzimas e os correspondentes valores das velocidades inicias de reacção (V). Os valores das cons­tantes cinéticas, Km e Vmáx foram, então, determinados recorrendo à equação de Lineweaver-Burk: 1/V = {(Km/Vmáx). (1/[S]) + (1/Vmáx)} (Equação 2.), a qual usa o inverso da equação de Michaelis-Menten (Tabatabay & Bremner, 1971). Na Figura 2, Vmáx corresponde ao valor de 1/[S] =0 e Km ao valor de 1/V=0 da equação anterior.

 

Figura 2 -Representação gráfica de Lineweaver-Burk para determinação das constantes cinéticas Km e Vmáx da reacção de desidrogenases (A) e urease (B) do solo em estudo.

 

Os valores obtidos foram, para as desi­drogenases, Km = 0,50 mM e Vmáx = 5,33 µmol min-1 g-1 e, para a urease, Km = 25,73 mM e Vmáx = 2,00x10-2 µmol min-1 g-1. Uti­lizando a equação de Michaelis-Menten os valores obtidos para as constantes cinéticas foram semelhantes (Km = 0,49 ± 0,17 mM; Vmáx = 5,31 ± 0,18 µmol min-1 g-1 para a actividade de desidrogenases, e Km = 25,78 ± 0,27 mM; Vmáx = 2,00x10-2 ± 0,03x10­2µmol min-1 g-1 para a actividade da urease), o que mostra que a equação de Lineweaver-Burk é aplicável neste caso.

Para as actividades de desidrogenases e urease, não se encontram descritos na litera­tura estudos para este tipo de solos. Os resultados do presente estudo mostram um valor de actividade de desidrogenases 102 vezes mais elevado do que os valores obti­dos em outros tipos de solo. Tal diferença poderá ter-se devido ao facto de no nosso estudo existir uma flora microbiana mais abundante do que no caso descrito na litera­tura (Taylor et al. 2002; Roldán et al, 2005), o que não foi estudado em ambos os casos; termos utilizado um solo em pousio há 10 anos, pois a actividade de desidrogenases pode diminuir significativamente com a fre­quência e profundidade da lavoura do solo (Roldán et al., 2005); termos utilizado o INT, pois a maioria dos estudos publicados foram obtidos com TTC (cloreto de 3,5­trifeniltetrazónio) e com este substrato os resultados são normalmente inferiores aos que se obtêm com INT (Trevors, 1984; Friedel et al., 1994); ou, finalmente, termos usado uma mistura extractante constituída por dimetilformamida/etanol, a qual permi­te quantificar valores mais elevados, nomeadamente em solos com teores médios ou elevados de argila (Camiña et al., 1998), como no solo que estudámos.

Relativamente à urease, os valores de actividade que obtivemos são da mesma ordem de grandeza de alguns descritos por outros investigadores, embora estes valores também sejam dependentes do tipo de solo, profundidade e vegetação (Sinsabaugh et al., 2000; Taylor et al., 2002; Roldán et al., 2005).

A velocidade máxima, Vmáx, mede a quan­tidade máxima de substrato que é transfor­mado por uma quantidade fixa de enzima, por unidade de tempo, o que nos permite determinar experimentalmente se uma determinada substância é capaz de actuar modificando a actividade enzimática. Sabe­se que numerosas substâncias com circula­ção ambiental são capazes de inibir a activi­dade de desidrogenases, da urease e de outros enzimas, afectando os processos naturais em que estes estão envolvidos e, consequentemente, a qualidade do solo.

No presente trabalho, depois de termos caracterizado as actividades de desidroge­nases e urease do solo em estudo, através da determinação do seu Vmáx e Km, proce­demos à avaliação do efeito de quantidades crescentes de Hg2+ e Pb2+ sobre as activi­dades dos referidos enzimas, tendo em vis­ta a determinação da concentrações efecti­vas para as quais se obteria 50% de inibi­ção dessa actividade (IC50), parâmetro este que permite comparar o efeito deletério dos xenobióticos sobre os microrganismos que lhes são sensíveis.

O efeito de Hg2+ e Pb2+ nas actividades de desidrogenases e da urease estão ilus­trados no Quadro 2., mostrando que o Hg2+ diminuiu significativamente as actividades de desidrogenases e urease (P < 0,05), enquanto que o Pb2+ apenas diminuiu sig­nificativamente a actividade da urease (P < 0,05).

Nos estudos em que se observou uma correlação dose-resposta significativa (P<0,05), os valores de actividade foram analisados de acordo com a Equação 1, referida anteriormente, tendo em vista o cálculo dos valores de IC50, e construíram­se as curvas dose-resposta das actividades de desidrogenases e urease versus concen­trações de Hg2+ ou Pb2+ , como ilustrado na Figura 3.

 

Figura 3 -Representação gráfica das curvas dose-resposta das actividades de desidrogenases e urease sensíveis à presença de Hg2+ e Pb2+.

 

A actividade de desidrogenases mostrou­se sensível à presença de Hg2+, com um valor de IC50 de 0,249 ± 0,018 mM, mas não se mostrou significativamente sensível à presença de quantidades vestigiais de Pb2+ (P > 0,05). Relativamente à actividade da urease, para concentrações até 1,4 mM de Hg2+ e 0,7 mM de Pb2+, observou-se um efeito potenciador desta actividade. No entanto, para concentrações mais elevadas destes metais observou-se uma diminuição da actividade da urease, com valores de IC50 de 3,47 ± 0,17 mM e de 3,31 ± 0,45 mM, para o Hg2+ e para o Pb2+, respectivamente.

Os estudos referidos na literatura que mais se aproximam do aqui descrito foram efectuados por Chaperon & Sauvé (2007, 2008). Estes investigadores utilizaram quantidades muito menores destes metais e outro tipo de solo com uma ocupação dife­rente, tendo obtido valores de IC50 cerca de cem vezes inferiores aos que obtivemos neste trabalho, o que pode querer significar que os enzimas do solo que analisámos são muito mais estáveis à presença de Hg2+ e Pb2+ do que no caso referido.

 

CONCLUSÕES

No trabalho que aqui apresentamos, dife­rentes concentrações de Hg2+ e Pb2+ produ­ziram, face a desidrogenases e urease, uma diminuição da actividade enzimática, mas em nenhum caso se obteve uma inibição total das referidas actividades. Isso mostra que num solo em pousio pode existir uma flora resistente à acção do Hg2+ e Pb2+ . Além disso, observou-se que o Pb2+ não ini­biu a actividade de desidrogenases, o que levanta a questão da flora microbiana do solo estudado ou de pelo menos uma parte importante da mesma, poder vir a ter inte­resse para beneficiar solos poluídos pelo Pb2+ em que esta actividade seja muito bai­xa. É neste sentido que os nossos estudos futuros se irão dirigir.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Brady, N. W. & Ray, R. 1999. The Nature and Properties of Soils, 12th Edition, MacMillan Publishing Co., New York.         [ Links ]

Camiña, F., Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F. & Leirós, C. 1998. Measurement of de­hydrogenase activity in acid soils rich in organic matter. Soil Biology & Bioche­mistry, 30: 1005-1011.

Cardoso, J. C. 1974. A Classificação dos Solos de Portugal – Nova Versão. Bole­tim de Solos, 17: 14-46. SROA, Secreta­ria de Estado da Agricultura, Lisboa.

Carter, M.R. 1993. Soil Sampling and Meth­ods of Analysis. Canadian Society of Soil Science, Lewis Publishers, CRC Press Inc., USA.

Chaperon, S. & Sauvé, S. 2007. Toxicity in­teraction of metals (Ag, Cu, Hg, Zn) to urease and dehydrogenase activities in soils. Soil Biology & Biochemistry, 39: 2329-2338.

Chaperon, S. & Sauvé, S. 2008. Toxicity in­teractions of cadmium, copper, and lead on soil urease and dehydrogenase activity in relation to chemical speciation. Ecotoxicology and Environmental Safety, 70 (1): 1-9.

Dick, R. P. 1998. Soil Enzymes Activities as Integrative Indicators of Soil Health. In C. Pankhurst, B. M. Doube & V. V. S. R Gupta (eds.) Biological Indicators of Soil Health, pp.121-156. CAB International, New York, USA.

Friedel, J.K., Mölter K. & Fischer W. R. 1994. Comparison and improvement of methods for determining soil dehydrogenase activity by using triphenyltetrazolium chloride and iodonitrotetrazolium chloride. Biology and Fertility of Soils, 18 (4): 291-296.

Greco, W.R., Bravo, G. & Parsons, J.C. 1995. The search for synergy: a critical review from a response surface perspec­tive. Pharmacology Review, 47: 331-385.

Greenberg, A. E., Clesceri, L.S. & Eaton, A.D. 1992. Standard Methods for the Ex­amination of Water and Wastewater, 18th edition. APHA, AWWA, WEF. USA.

Kandeler, E. & Gerber, H. 1988. Short-term assay of soil urease activity using colori­metric determination of ammonium. Bi­ology and Fertility of Soils, 6: 68-72

Marzadori, C., Miletti, S., Gessa, C. & Ciurli, S. 1998. Immobilization of Jack Bean Urease on hydroxyapatite: urease immo­bilization in alkaline soils. Soil Biology & Biochemistry, 30: 1485-1490.

Monkiedje, A., Ilori, M.O. & Spiteller, M. 2002. Soil quality changes resulting from the application of the fungicides me­fenoxam and metalaxyl to a sandy loam soil. Soil Biology & Biochemistry, 34: 1939-1948.

Mora, A. P., Calvo, J. J. O., Cabrera, F. E & Madejón, E. 2005. Changes in enzyme activities and microbial biomass after “in situ” remediation of a heavy metal­contaminated soil. Applied Soil Ecology, 28: 125-137.

Nannipieri, P., Ascher, J., Ceccherini, M.T., Landi, L., Pietramellara, G. & Renella, G. 2003. Microbial diversity and soil func­tions. European Journal of Soil Science, 54: 655-670.

Roldán, A., Salinas-García, J. R., Alguacil, M. M. & Caravaca, F. 2005. Changes in soil enzyme activity, fertility, aggregation and C sequestration mediated by conser­vation tillage practices and water regime in a maize field. Applied Soil Ecology, 30: 11-20.

Rowell, D.L. 1994. Soil Science. Methods and Applications. Longman Scientific Technical, Harlow, England.

Sinsabaugh, R. L., Reynolds, H. & Long, T. M. 2000. Rapid assay for amidohydrolase (urease) activity in environmental sam­ples. Soil Biology & Biochemistry, 32: 2095-2097.

Sukul, P. 2006. Enzymatic activities and mi­crobial biomass in soil as influenced by metalaxyl residues. Soil Biology & Bio­chemistry, 38: 320-326.

Taylor, J. P., Wilson, B., Mills, M. S. & Burns, R. G. 2002. Comparison of mi­crobial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques. Soil Biology & Biochemistry, 34: 387-401.

Tabatabai, M. A. & Bremner, J. M. 1971. Michaelis Constants of soil enzymes. Soil Biology & Biochemistry, 3: 317-323.

Trasar-Cepeda, C., Leirós, S., Seoane, S. & Gil-Sotres, F. 2000. Limitations of soil enzymes as indicators of soil pollution. Soil Biology & Biochemistry, 32: 1867­1875.

Trevors, J.T., 1984. Dehydrogenase activity in soil. A comparison between the INT and TTC assay. Soil Biology & Bio­chemistry, 16: 673-674.

von Mersi, W. & Schinner, F., 1991. An im­proved and accurate method for deter­mining the dehydrogenase activity of soils with iodonitrotetrazolium chloride. Biology and Fertility of Soils, 11: 216­-220.

Creative Commons License Todo o conteúdo deste periódico, exceto onde está identificado, está licenciado sob uma Licença Creative Commons